Por Dra. Carolina Vaisman
Hasta ahora, la prueba más confiable y utilizada para el diagnóstico de COVID-19 es la prueba de RT-PCR. que realiza con hisopos nasofaríngeos u otras muestras del tracto respiratorio superior, incluido el hisopado faríngeo y, más recientemente, la saliva. Sin embargo, las pruebas serológicas son muy útiles para monitorear el curso de la enfermedad. Se realizan, a diferencia de la RT-PCR, con el suero que se separa de la sangre del paciente.
El diagnóstico serológico es una herramienta importante para comprender el alcance de COVID-19 en la comunidad e identificar a las personas inmunes y potencialmente protegidas contra la infección. Puede realizarse mediante dos tipos de ensayos: inmunocromatográficos o lateral flow y ELISA. En esta ocasión explicaré de qué se trata este último.
ELISA, además del nombre de una composición de Beethoven, es el nombre de una técnica de laboratorio. ELISA es un acrónimo de Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, es decir ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima. Esta técnica se utiliza para detectar tanto la presencia de anticuerpos o antígenos, como proteínas y glicoproteínas en muestras biológicas. Algunos ejemplos son: test de embarazo, medición de citocinas o receptores solubles en sobrenadantes celulares o suero, hormonas, marcadores tumorales, etc. Para la bioquímica clínica los ensayos ELISA son una herramienta muy útil para el inmunodiagnóstico debido a su sensibilidad y especificidad, a la facilidad en su procedimiento y, sobre todo, a la seguridad respecto a otras técnicas que usan materiales radioactivos. Se considera que un ensayo muestra sensibilidad clínica cuando en forma exacta y reproducible puede asegurar que no ocurren falsos negativos.
FUNDAMENTOS DE LA TÉCNICA
Un inmunoensayo es una prueba que mide el reconocimiento específico entre un anticuerpo y un antígeno. A este reconocimiento químico se lo conoce como inmunocomplejo (IC) y es tan selectivo y estrecho como una llave con su cerradura.
Se han establecido muchos formatos de ensayos ELISA cualitativos y cuantitativos; los primeros sólo indican la presencia o ausencia del IC y los otros detectan cuánto hay de ellos. Básicamente el método consiste en que uno de los componentes inmunológicos (ya sea al antígeno o el anticuerpo) se inmoviliza en una fase sólida, en pocillos de una placa de microtitulación de poliestireno o placa de ELISA. La interacción anticuerpo-antígeno se puede visualizar mediante enzimas, unidas a antígenos o anticuerpos secundarios. La enzima unida, que generalmente es peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina, genera un cambio de color en el sustrato agregado que puede medirse mediante un espectrofotómetro llamado lector de placa. Generalmente los ELISA se llevan a cabo en placas de 96 pocillos, lo que permite medir múltiples muestras en un único experimento y así ahorrar tiempo.
Los compuestos quimioluminiscentes también pueden usarse para marcar analitos. Una marca quimioluminiscente produce alta emisión de luz cuando se lo combina con un sustrato especial siendo altamente sensible. Muchos instrumentos en el laboratorio clínico se basan en la tecnología quimioluminiscente.
ETAPAS Y UTILIDAD EN COVID 19 En la sangre de un paciente infectado por el virus SARS-CoV-2, pueden detectarse los anticuerpos producidos con una prueba de ELISA. A continuación, se describen los pasos de una prueba ELISA de anticuerpos típica.
- En el pocillo de la placa, donde está absorbido el antígeno específico de SARS-CoV-2, se agrega el suero del paciente.
- Si el paciente tiene anticuerpos contra el SARS-CoV-2, éstos reconocen al antígeno formando el IC. Entre cada paso la placa es lavada con una solución de detergente suave para remover células, proteínas o anticuerpos que no son específicos.
- Se agrega a continuación, el anticuerpo de captura o detección que está marcado con la enzima. El exceso de anticuerpo se elimina con un lavado.
- Se agrega el sustrato de la enzima. Se incuba.
- En los pocillos que contienen muestras de pacientes que han sido infectados con el SARS-CoV-2 y por lo tanto tienen anticuerpos contra el virus, los anticuerpos marcados con la con la enzima actúan sobre sustrato el cual cambia de color, lo que indica una prueba positiva.
- Este cambio de color si bien puede verse a simple vista, se lee o cuantifica mediante un espectrofotómetro o lector de placa.
- Si el paciente no hubiera sido infectado con COVID-19, el anticuerpo ligado a la enzima no se adhiere a nada en el pozo y el sustrato no cambia de color. Esto representaría una prueba negativa.
TIPOS Y CURVA DE ANTICUERPOS DETECTADOS
El diagnóstico serológico es especialmente importante para pacientes con enfermedad leve a moderada que pueden presentar los síntomas después de las primeras semanas de inicio de la enfermedad. El marcador serológico más sensible y más temprano es el total de anticuerpos (IgA, IgM, IgG) los cuales, según los estudios publicados, comienzan a aumentar a partir de la segunda semana del comienzo de los síntomas.
En todos los pacientes estudiados la seroconversión de IgM e IgG se produjo entre la tercera y la cuarta semana del inicio de la enfermedad clínica (Fig. 2). Posteriormente, la IgM comienza a disminuir y alcanza niveles más bajos por la semana 5 y casi desaparece en la semana 7, mientras que la IgG persiste más de 7 semanas. En un estudio de 140 pacientes, la sensibilidad combinada de RT-PCR y ELISA de IgM dirigida al antígeno de nucleocápside (NC) fue del 98.6% frente al 51.9% con una sola prueba de PCR. Durante los primeros 5.5 días, la RT-PCR cuantitativa tuvo una tasa de positividad más alta que la IgM, mientras que el ELISA IgM tuvo una tasa de positividad más alta después del día 5.5 de la enfermedad. He aquí la importancia de la complementariedad entre estas dos pruebas. Las pruebas de anticuerpos IgM e IgG basadas en ELISA tienen una especificidad mayor al 95% para el diagnóstico de COVID-19.
Las pruebas de muestras de suero emparejadas con la PCR inicial y las 2 semanas posteriores pueden aumentar aún más la precisión del diagnóstico. Por lo general, la mayoría de los anticuerpos se producen contra la proteína más abundante del virus, que es la NC. Por lo
tanto, las pruebas que detectan anticuerpos contra NC serían las más sensibles. Sin embargo,
los anticuerpos contra el dominio de unión al receptor de la proteína S (RBD-S) que, es la proteína de unión al huésped, son más específicos y al parecer no sólo serían neutralizantes, sino que también no cruzarían con otros coronavirus. Por lo tanto, el uso de uno o ambos antígenos (NC y RBD-S) para detectar IgG e IgM (los primeros que se generan) produciría una alta sensibilidad. De todos modos, los demás anticuerpos generales como los dirigidos contra la proteína S (Spike) pueden tener reactividad cruzada con SARS-CoV y posiblemente otros coronavirus. Hay que tener en cuenta que las pruebas rápidas comerciales para la detección de anticuerpos son de calidad variable y, además, muchos fabricantes no revelan la naturaleza de los antígenos utilizados. Estas pruebas son de naturaleza puramente cualitativa y sólo pueden indicar la presencia o ausencia de anticuerpos contra el SARS-CoV-2. Si bien la presencia de anticuerpos neutralizantes sólo puede confirmarse mediante una prueba de neutralización de reducción de placa, se ha demostrado que los títulos altos de anticuerpos IgG detectados por ELISA se correlacionan positivamente con anticuerpos neutralizantes.
El otro tipo de anticuerpo que también puede medirse por ELISA es la IgA secretora, la inmunoglobulina más importante que desempeña un papel crucial en la defensa inmune de las superficies mucosas, el primer punto de entrada del SARS-CoV-2. Hasta el momento hay una falta de estudio sobre la producción de IgA en pacientes con COVID-19. Como barrera inmune, la IgA secretora podría neutralizar el SARS-CoV-2 antes de que alcancen y se unan a las células epiteliales, siendo éste el fundamento y enfoque de la propuesta vacuna oral contra el COVID-19. La cantidad de IgA específica contra el RBD en la mucosa respiratoria puede servir como un indicador de la respuesta inmune del huésped, que se puede medir directamente en la saliva y las lágrimas y hace posible utilizar la detección de IgA como un marcador de diagnóstico temprano. Además, las pruebas de serología basadas en IgA dirigidas a la proteína Spike específica de SARS-CoV-2 y la proteína nucleocápside (NC) pueden representar un enfoque diagnóstico y terapéutico importante.
En conclusión. las pruebas serológicas deben ser un complemento de la prueba diagnóstica de oro, la RT-PCR. En ningún momento la debe reemplazar, ya que la serología es útil sólo para monitorear la enfermedad. Nos brinda información acerca de si la persona está cursando (IgM, IgA) la enfermedad o si está convaleciente o ya la resolvió (IgG). Algo que debe quedar más que claro es que ninguna de las pruebas de RT-PCR, ELISA ni inmunocromatografía evalúan la “viabilidad viral”, que se hace a través del cultivo del virus. Este punto debe tenerse muy presente en los casos donde las RT-PCR dan aún positivas cuando el paciente ya se ha recuperado, aunque este tema no es parte de este blog.
Por último, hay que enfatizar que tanto la persistencia a largo plazo y la duración de la protección conferida por los anticuerpos neutralizantes sigue siendo DESCONOCIDA. Por lo tanto, hasta ahora aún quedan muchas preguntas, particularmente cuánto tiempo dura la “inmunidad potencial” en individuos infectados con SARS-CoV-2 sean sintomáticos o asintomáticos. Mi consejo es que sigas cuidándote para cuidarnos.
BIBLIOGRAFÍA Y LECTURAS SUGERIDAS
- Joseph A. Bellanti et al. Immunology IV: Clinical Applications in Health and Disease, I Care Press, 2012
- https://www.cebm.net/covid-19/what-tests-could-potentially-be-used-for-the-screening-diagnosis-and-monitoring-of-covid-19-and-what-are-their-advantages-and-disadvantages/
- Sethuraman N et al. Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2. JAMA. 2020;323(22):2249–2251. doi:10.1001/jama.2020.8259
- Premkumar L, et al. The RBD Of The Spike Protein Of SARS-Group Coronaviruses Is A Highly Specific Target Of SARS-CoV-2 Antibodies But Not Other Pathogenic Human and Animal Coronavirus Antibodies.MedRxiv, 2020 May. 10:2020.05.06.20093377. doi: 10.1101/2020.05.06.20093377. Preprint.
- Li Guo et al. Profiling Early Humoral Response to Diagnose Novel Coronavirus Disease (COVID-19), Clinical Infectious Diseases, 2020. https://doi.org/10.1093/cid/ciaa310
- Yin Xia Chao et al. The role of IgA in COVID-19. Brain, Behavior, and Immunity, Volume 87,
2020, Pages 182-183. (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0889159120310473)
